02Chip-seq操作流程

Chip-seq操作流程

1. 数据过滤Trimmomatic

可以参考我RNA-seq篇章中关于Trimmomatic的使用

2. Bowtie2进行比对

• 软件安装

  直接下载编译好的版本就可以使用了

• 建立索引

  bowtie2-build 基因组fasta文件 索引文件目录/索引前称  --threads 10 2>bowtie-build.log

• 开始比对

  bowtie2 --threads 10 -x 索引所在位置 -1 过滤后的文件 -2 过滤后的文件 -S 输出sam文件

• 去除由于PCR重复产生的reads

  #将sam文件转换为bam文件并且按照染色体顺序排好序
  samtools view -bS -@ 10 bowtie比对的sam文件 >输出的bam文件
  #将reads按照染色体排序
  samtools sort -@ 10 上一步的bam文件 -o 指定输出文件名
  ## 去除PCR重复
  samtools rmdup 排好序的bam文件 rmdup.bam文件

3. 使用MACS进行比对

3.1 软件安装

https://github.com/taoliu/MACS/blob/master/INSTALL.md

## 使用Anconda进行安装
conda create --name MACS
conda activate MACS
conda install -c bioconda macs2
## 离开环境
conda deactivate

3.2 软件使用

macs2 callpeak -t ChIP.bam -c Control.bam -f BAM -g hs -n test -B -q 0.05

• -t 接处理文件

• -c 控制文件

• -f 输入文件格式

• -g 根据比对时canker基于组的大小而定

• -n 输出文件名前缀

• -B -q FDR值

3.3 解读输出文件

• NAME_peaks.xls文件每个峰的起始位置，和其他统计信息

• NAME_peaks.narrowPeak BED6+4格式，可以在USCS基因组浏览器中打开它

  前几列的信息比较好理解，这是后几列的具体信息

  • 5th: integer score for display. It's calculated as int(-10*log10pvalue) or int(-10*log10qvalue) depending on whether -p (pvalue) or -q (qvalue) is used as score cutoff. Please note that currently this value might be out of the [0-1000] range defined in UCSC ENCODE narrowPeak format. You can let the value saturated at 1000 (i.e. p/q-value = 10^-100) by using the following 1-liner awk: awk -v OFS="\t" '{$5=$5>1000?1000:$5} {print}' NAME_peaks.narrowPeak
  • 7th: fold-change at peak summit

  • 8th: -log10pvalue at peak summit

  • 9th: -log10qvalue at peak summit

  • 10th: relative summit position to peak start

• NAME_summits.bed 相当于NAME_peaks.narrowPeak文件的精简版

• NAME_peaks.broadPeak 在--broad模式下才会生成

• NAME_peaks.gappedPeak 在--broad模式下才会生成

• NAME_model.r 画图的R脚本 $ Rscript NAME_model.r

• TheNAME_treat_pileup.bdg 对应处理样品的数据

• NAME_control_lambda.bdg 对应对照样品的数据 bdgcmp命令能够对着两个文件进行比较

4. call peaks统计每个区域的峰值

参考

1. samtools使用 https://www.cnblogs.com/emanlee/p/4316581.html
2. MACS软件 https://github.com/taoliu/MACS/
3. Bedtools使用 https://www.jianshu.com/p/6c3b87301491

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