01三代测序Iso-seq

PacBio三代全长转录组测序

分析流程

https://github.com/PacificBiosciences/IsoSeq/blob/master/README_v3.1.md

分析流程

这张图片形象的展示了每一步测序数据的变化

测序说明

1.安装SMART软件

从网站https://www.pacb.com/support/software-downloads/下载SMART-Link软件

./smrtlink_7.0.1.66975.run  --rootdir  /public/home/zpliu/software/smrtlink --smrttools-only

• --rootdir 指定安装路径

• --smrttools-only 只安装命令行工具，反正服务器里你图形界面也看不到

版本升级，下载升级版本的安装文件，然后只需要在安装的命令上面加个参数就行

./新版本的安装程序  --rootdir  /public/home/zpliu/software/smrtlink --smrttools-only  --upgrade

之后将安装的命令添加到环境变量中

export PATH=" /public/home/zpliu/software/smrtlink/smrtcmds/bin:$PATH"

2.使用CCS对原始数据进行过滤

ccs 
--noPolish 
--minPasses 1 
--minLength 300 
--minSnr 4 
--maxLength 10000 
--maxDropFraction 0.8 
--minPredictedAccuracy  0.8
--numThreads 20 
--logFile  ccs.log 
--reportFile repoet_css.txt input_subreads.bam  output.bam

• noPolish 不会对数据进一步的过滤

• -minPasses 最低的通过值

• minLength 获取的draft consensus最短长度，用于下一步的分析

• maxLength 最长的长度

• minSnr 移除包含delete的SNP

• -minPredictedAccuracy 最小精度0.8

• --logFile 记录日志文件

• -reportFile 报告处理的文件

• maxDropFraction Maximum fraction of subreads dropped by polishing

3.对转录本进行无参考基因组的归类

引物文件是固定的

$ cat primers.fasta
>primer_5p
AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATGGGG
>primer_3p
AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC

3.1 去除引物

lima output.bam primers.fasta demux.ccs.bam --isoseq --no-pbi -j 线程数 --min-length 300

3.2 去除full length 的噪音remove polyA tails

#v7版本的命令
 isoseq3 refine 前缀primer_5p--primer_3p.bam  primers.fasta movie.flnc.bam
 #v8版
  isoseq3 refine movie.fl.P5--P3.bam primers.fasta movie.flnc.bam

3.3 聚类

` isoseq3 cluster movie.flnc.bam unpolished.bam ·

:warning:如果想要比较同源基因之间的差异的话，这一步可以不做

3.4打磨 polich

isoseq3 polish -j 20 unpolished.bam input_subreads.bam polished.bam

4.比对到参考基因组

4.1 软件安装

#下载最新版软件
./configure --prefix=自定义安装路径
make 
make install

4.2 建立参考基因组

gmap_build -D 存放索引的目录 -d G.arboreum.Chr.v1.0 基因组fasta文件

4.3 将全长转录本比对到参考基因组

gmap -D 索引所在目录 -d 索引文件前缀 -f samse -t 10 -n 2 polished.hq.fasta >gmap.sam 2>gmap.err 
## 推荐使用这种方法,不然老是报错
cat fasta|gmap -D 索引所在目录 -d 索引文件前缀 -f samse -t 10 -n 2   >gmap.sam 2>gmap.err

• -f 输出文件为sam格式

• -t 指定线程数目

• -n 设置比对的类型，为0可以鉴定嵌合基因

4.4 根据SNP数据区分多倍体reads

transcript/963  16      Chr01   1836618 0       62S165M1I453M74N371M119N348M172N    *       0       0       GATCTCTACCATAAGCTTTTAGCAATGCCAAAATCAGTAAGATGAGCCTCTAAATCCTTGTCCAACAAAATATTTGATGACTTCACATCCCTGTGGATGATTCGTGGACTACAGTCATGATGTAAATACGCTAACCCTTGTGCAGCTCCCAGTGCAATCTTTAATCGAATGTTCCAACTGAGAACTTTCTTCTTGGTAGAAACATGGAGGAGATCCCAGAGACTGCCATTTTCCATATAGTCATAGAAGAGAAGGTTCCGAGACGGGGAGAGAGAATACCCTTGAAGGCTGACCAGATTTCGGTGCTTAATACTCCCAATTGTCTCGAGTTCTGTCTCGAATTCCTTCAAGCATTGTGGATAGTGAGAGTAGAGCCACTTGATGGCAACTGGCCT     *       MD:Z:97T72C38A23T42G109G36C1
5C47A89G20T100G16G141G77A11C10C5C10C17    NH:i:1  HI:i:1  NM:i:62 SM:i:40 XQ:i:24 X2:i:0  XO:Z:UU XS:A:-

对于mapping状态可分为以下几类：

• M：alignment match (can be a sequence match or mismatch)

  表示read可mapping到第三列的序列上，则read的碱基序列与第三列的序列碱基相同，表示正常的mapping结果，M表示完全匹配，但是无论reads与序列的正确匹配或是错误匹配该位置都显示为M

• I：insertion to the reference

  表示read的碱基序列相对于第三列的RNAME序列，有碱基的插入

• D：deletion from the reference

  表示read的碱基序列相对于第三列的RNAME序列，有碱基的删除

• N：skipped region from the reference

  表示可变剪接位置

• P：padding (silent deletion from padded reference)

• S：soft clipping (clipped sequences present in SEQ)

• H：hard clipping (clipped sequences NOT present in SEQ)

  clipped均表示一条read的序列被分开，之所以被分开，是因为read的一部分序列能匹配到第三列的RNAME序列上，而被分开的那部分不能匹配到RNAME序列上。

• "="表示正确匹配到序列上

• "X"表示错误匹配到序列上

5.TaMa将很相似的转录本合并去冗余

合并转录本

这个过程很复杂，图中就有两种可能的合并方式：

• Transcription Start Site Collapse

• Exon Cascade Collapse

具体可以查看这篇文献 https://bmcgenomics.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12864-017-3691-9

5.1 下载和安装

#发现我没有pip2安装走一波

#下载文件
wget https://bootstrap.pypa.io/get-pip.py --no-check-certificate
#执行安装
python get-pip.py --user

git clone https://github.com/GenomeRIK/tama
#也可以之间在windows下载好rz 进去
#程序基于python2运行 ，需要安装Biopython module模块
pip install --upgrade pip  --user # 更新pip
pip install Biopython  --user

运行tama_collapse.py 脚本

/usr/bin/python tama_collapse.py  -s ../gmap_sort.sam  -f ../../Gr_genome/Graimondii_221_v2.0.fa    -p tama -x capped

每个参数的详细说明 https://github.com/GenomeRIK/tama/wiki/Tama-Collapse

6.Cupcake去除冗余，这个步骤和5是一样的 推荐这个流程

6.1 安装Cupcake软件，这个流程适合依赖于python2的cupcake，应该克隆对应的Py2_v8.7.x. 分支

首先得安装cogent环境 https://github.com/Magdoll/Cogent/wiki/Installing-Cogent#conda

## 创建anaCogent环境
conda create --name anaCogent python=2.7 anaconda
## 进入anaCogent环境
conda activate anaCogent
## 安装依赖
conda install -n anaCogent biopython -y
conda install -n anaCogent -c bcbio bx-python -y
conda install -n anaCogent -c conda-forge pulp -y
## 安装cogent
cd <your_dir>
git clone https://github.com/Magdoll/Cogent.git
cd Cogent
git checkout 
git submodule update --init --recursive
cd  Complete-Striped-Smith-Waterman-Library/src
make
export LD_LIBRARY_PATH=$LD_LIBRARY_PATH:<your_dir>/Cogent/Complete-Striped-Smith-Waterman-Library/src
export PYTHONPATH=$PYTHONPATH:<your_dir>/Cogent/Complete-Striped-Smith-Waterman-Library/src
cd ../../
python setup.py build
python setup.py install
## 可以将export两行命令加入到.bashrc文件中

## 开始安装cupcake，选择对应的Py2_v8.7.x. 分支
git clone -b Py2_v8.7.x  https://github.com/Magdoll/cDNA_Cupcake.git
cd cDNA_Cupcake/
python setup.py build
python setup.py install

6.2 安装依赖于python3.7环境的cupcake

参考 https://github.com/Magdoll/cDNA_Cupcake/tree/master

conda create --name Cupcake python=3.7 
conda activate Cupcake 
conda install Biopython 
git clone  https://github.com/Magdoll/cDNA_Cupcake.git
##添加到环境变量
export PATH=$PATH:<path_to_Cupcake>/sequence/
export PATH=$PATH:<path_to_Cupcake>/rarefaction/ ## 这不找不到，不加了
cd cDNA_Cupcake/
python setup.py build
python setup.py install
collapse_isoforms_by_sam.py -h

6.3 具体的使用方法

参考 https://github.com/Magdoll/cDNA_Cupcake/wiki/Cupcake-ToFU%3A-supporting-scripts-for-Iso-Seq-after-clustering-step#what

## 将Gmap得到的sam结果文件进行排序
sort -k 3,3 -k 4,4n gmap.sam >gmap_sorted.sam
## 结合gmap的比对结果去除冗余的转录本
collapse_isoforms_by_sam.py --input polished.hq.fastq --fq  -s gmap_sorted.sam -o tama/test --dun-merge-5-shorter -c 0.95 -i 0.85

• --input 输入文件

• --fq 指定输入文件为fastq

• -s Gmap输出后的sam文件经过sorted

• -o 输出文件前缀，当然也可以加目录，直接输出到对应目录下

• -c 最小覆盖度

• -i 相似度

• --dun-merge-5-shorter 5‘端的read由于测序的原因可能是真是存在差别，也可能是冗余；跟建库方式有关；因为设计引物数利用ployA的，所以5’端的序列可能没有完全扩到

过滤因为5’端测序的误差，导致冗余没有完全去除

filter_away_subset.py test.collapsed

7.与已有的注释信息进行比较

https://github.com/TomSkelly/MatchAnnot

/usr/bin/python ~/software/MatchAnnot/matchAnnot.py  --gtf 已经发表的基因组gtf文件  --format alt gmap的比对结果sam文件需要按照染色体顺序排好序  >111

报错

raise RuntimeError ('chromosome %s not in annotation' % chr)
RuntimeError: chromosome scaffold_662 not in annotation
## 基因组注释文件里没有这个scaffold的煮熟信息，但是基因组序列在建库的时候有，比对的sam结果里就会有

8.Alternative splice.py脚本进行分类

git clone https://github.com/liangfan01/pipeline-for-isoseq.git --depth 1
## 脚本在other目录下，依赖于python2
## 先退出conda，回到bash下
conda deactive
## 安装依赖包
pip2 install svgwrite --user
pip2 install networkx --user 
## 我的python环境被污染了，只能指定对应的python
/usr/bin/python alternative_splice.py -i gfffile  -g 参考基因组文件gtf文件 -f 参考基因组文件  -o 输出路径 -os -as -ats T -op

:warning:alternative_splice.py脚本中使用的参考基因组的gtf文件还需要使用awk，进行转化

awk '{print $1 "\t" $2 "\t" $3 "\t" $4 "\t" $5 "\t" $6 "\t" $7 "\t" $8 "\t" $11 " " $12 " " $9 " " $10}' cufflinks转化后的gtf文件 >最后可以使用的gtf文件

输出文件

$ tree
.
├── acceptor.list.txt
├── alternative.splice.list.txt
├── donor.list.txt
├── error.orient.list.txt
├── gene.cluster.picture
├── novel.gene.list.txt
├── proved.transcript.list.txt
├── splice.ascode.list.txt
├── splice.ascode.stat.txt
├── transcript.cluster.list.txt
├── unproved.gene.list.txt
└── unproved.transcript.list.txt

暂时就更新到这里了~~~

鉴定可变剪切spladder

参考文档 https://spladder.readthedocs.io/en/latest/installation.html

在Ancona中安装这个软件

• 进行可变剪切的鉴定

  spladder build -a ../../../07_annotation/merge.gtf  -b ../test.bam  -c 1 -o ./ --merge-strat single

参考

完整的分析 流程 https://github.com/GenomeRIK/tama/wiki

PacBio官方SMART软件使用说明V8版本的 single molecular real-time

https://www.pacb.com/wp-content/uploads/SMRT-Tools-Reference-Guide-v8.0.pdf

https://www.cnblogs.com/RyannBio/p/9598340.html

GMap软件 http://research-pub.gene.com/gmap/

samtools输出文件格式 https://blog.csdn.net/genome_denovo/article/details/78712972

全长转录本分类https://github.com/GenomeRIK/tama/wiki/Tama-Collapse

Cupcake分析流程 https://github.com/Magdoll/cDNA_Cupcake/wiki/Cupcake-ToFU:-supporting-scripts-for-Iso-Seq-after-clustering-step#what

去除冗余之后的分析流程 https://github.com/PacificBiosciences/IsoSeq_SA3nUP/wiki/What-to-do-after-Iso-Seq-Cluster%3F