# Cell Ranger count使用手册 ***当bcl的下机数据经过mkfastq分析之后得到的fastq1数据用于下游分析*** fastq文件的来源有很多例如 * mkfastq流程得到的fastq文件 * 公共数据库发表的SRA文件 * bamtofastqwenj等等 ### 如果使用的是mkfastq得到的fastq文件目录结构 ``` MKFASTQ_ID |-- MAKE_FASTQS_CS `-- outs |-- fastq_path |-- HFLC5BBXX |-- test_sample1 | |-- test_sample1_S1_L001_I1_001.fastq.gz | |-- test_sample1_S1_L001_R1_001.fastq.gz | |-- test_sample1_S1_L001_R2_001.fastq.gz | |-- test_sample1_S1_L002_I1_001.fastq.gz | |-- test_sample1_S1_L002_R1_001.fastq.gz | |-- test_sample1_S1_L002_R2_001.fastq.gz | |-- test_sample1_S1_L003_I1_001.fastq.gz | |-- test_sample1_S1_L003_R1_001.fastq.gz | `-- test_sample1_S1_L003_R2_001.fastq.gz |-- test_sample2 | |-- test_sample2_S2_L001_I1_001.fastq.gz | |-- test_sample2_S2_L001_R1_001.fastq.gz | |-- test_sample2_S2_L001_R2_001.fastq.gz | |-- test_sample2_S2_L002_I1_001.fastq.gz | |-- test_sample2_S2_L002_R1_001.fastq.gz | |-- test_sample2_S2_L002_R2_001.fastq.gz | |-- test_sample2_S2_L003_I1_001.fastq.gz | |-- test_sample2_S2_L003_R1_001.fastq.gz | `-- test_sample2_S2_L003_R2_001.fastq.gz |-- Reports |-- Stats |-- Undetermined_S0_L001_I1_001.fastq.gz ... `-- Undetermined_S0_L003_R2_001.fastq.gz ``` ## Single Cell RNA-Seq 分析 ### 输入fastq的参数介绍 * \--fastqs 用于指定包含输入fastq文件的路径 * \--sample 用于限制用于分析的样品 * \--lane 用于限制芯片中的通道 * \--indices 只在cellranger demux的输出类型中使用，例如--indices=SI-GA-A1只处理**SI-GA-A1**样品 ### fastq文件命名规则 **\[Sample Name]*****S1\_L00\[Lane Number]*****\[Read Type]\_001.fastq.gz** * 序列类型主要有 * `I1`: Sample index read (optional) * `R1`: Read 1 * `R2`: Read 2 ### 实践 * 数据来源于软件包自带的数据 * 数据集中包含有bcl下机数据 * mkfastq转换后的fastq数据 * 参考基因组的数据 ``` cellranger count --id=sampletest --fastqs=/public/home/zpliu/software/cellranger-3.0.2/cellranger-tiny-fastq/3.0.0 --sample=tinygex --expect-cells=1000 --transcriptome=/public/home/zpliu/software/cellranger-3.0.2/cellranger-tiny-ref/3.0.0 --expect-cells=1000 ``` ### 一些参数的选择 * **--localcores**：用于设置程序的核心数，不设置的话，默认是使用系统所能够使用的最多的核心 * **--localmem** ：限制cellrange使用的内存数 * **except-cells**：期望得到的细胞数目 默认是3000个，一般大家都设置1000 * **--force-cells**：强制多少个细胞会通过cell detection algorithm算法；当这个条形码图与cell range结果不一致的时候 * **--lanes**：限制某一个样品泳道进行分析 * **--transcriptome=DIR**:指定参考基因组文件，用于比对和计算基因表达量的 ### 定制reference目录 首先定制reference目录是需要基因组文件和对应的GTF文件的，**需要注意的是GTF和基因组中的染色体信息是要能够匹配的** 1. 过滤GTF文件 ```bash cellrange mkgtf input.gtf output.gtf --attribute=键值对 ``` > 但是我感觉为的gtf文件里键值对没啥可以过滤的属性，这一步就可以直接忽略 ​ 2.定制reference ```bash cellrange mkref 脚本将会对输入的基因组序列和gtf文件进行分析 ``` * **参数介绍** * **--genome=**：指定输出的文件夹的名字 * **--fasta**=：指定基因组序列的路径，如果有多个基因组可以使用这个参数多次 * **--genes=** ：指定注释文件的路径，当指定了多个基因组的时候，也需要指定多个注释信息 * **--nthreads**：指定线程的数目，默认是1个 * **--memgb**：最大内存使用数目，默认是16Gb，这个参数必须要大于基因组文件的大小，不然肯定内存不足 * **--ref-version**：指定版本信息，这个参数是可选的 * 多个基因组的例子 ```bash $ cellranger mkref --genome=hg19 --fasta=hg19.fa --genes=hg19-filtered-ensembl.gtf \ --genome=mm10 --fasta=mm10.fa --genes=mm10-filtered-ensembl.gtf ``` ## Feature Barcoding technology分析 输出结果是几个barcode矩阵，其中包含了每个细胞的barcode和基因的表达信息 1. 首先程序从特征库文件中提取和校正barcode序列和UMI序列 2. 接着将这些barcode序列与声明的特征文件中的序列进行比对，最终得到每个特征码的数目 #### 参数说明 * **libraries==CSV** :申明数据来源，在csv文件中需要有两中类型的fastq文件，一个是标准的gene expression reads另一个是Feature Reference reads文件；文件中声明 * fastqs文件所在目录 * 样品名称 * 文库类型 * 一种是标准的单细胞基因表达reads文库 * 另外一种是特征barcoding reads文库就包括**Antibody Capture**、 **CRISPR Guide Capture** * **--feature-ref=CSV** : 声明使用到的Barcode 试剂的类型 * ID：给barcode指定编号，不要与基因名字冲突 * name * read：指明哪条序列包含了barcode信息，一般是**R2** * pattern：提取barcode的模式只有 **5P（^）**和**3P（$）**两种 * sequence： 与barcode相关联的序列，一般是抗体序列或者sgRNA的原型间隔序列 * feature\_type： 与libraries中设置的文库类型是一致的 * target\_gene\_id：是在CrisPR中用到的 * target\_gene\_name