Post-transcriptional splicing of nascent RNA contributes to widespread intron retention in plants

Abstract

在真核生物中，基因在RNA聚合酶II的作用下倍转录成成mRNA，其中多数时候intron是在转录的过程中被剪切复合体剪切掉。在酵母的long-read sequencing研究中发现，当聚合酶II越过内含子时，剪切随即发生。本文基于Nanopore测序技术，绘制了结合在染色质上的RNA图谱，与此同时能够在全基因组范围检测剪切状态、聚合酶II的位置、多聚腺苷酸化。通过分析发现，在聚合酶II越过3‘剪切位点1Kb后，仍旧有超过半数的intron仍旧保持未剪切的状态；相比于酵母，植物中的剪切速率慢的多。许多全长的chromatin-bound RNA在多聚腺苷化后，仍旧包含有未剪切的内含子。而这些内含子在细胞质中几乎是不存在的，对nonsense-mediate decay具有抵抗力，表明这些RNA是在转录完成后、被释放到细胞质之前完成剪切的；作者给这类intron下了一个定义，post-transcriptionally splice intron pts intron.对来自公共数据库中6500份RNA-sequencing分析后，发现pts intron的剪切依赖于剪切相关蛋白PRMT5、SKIP同时又受到各种环境信号的影响。在拟南芥中大多数内含子保留事件是发生在pts introns，表明pts intron是内含子保留事件的主要来源，也可能是机体产生有功能的mRA的一种快速响应机制。

introduction

在真核生物中，pre-mRNA的剪切是mRNA成熟中一个基本的过程，并且剪切是转录往往同时进行。之前的研究通过人工合成pre-mRNA，在体外重构了剪切事件这一过程，帮助我们很好的理解了剪切位点的识别以及剪切复合体的组装。随着高通量测序技术的绘制新生RNA的图谱，极大的促进了在全基因组水平量化剪切事件，同时精准的追踪聚合酶II。但是研究剪切和转录之间的关系存在很大的困难，因为在同一个转录本上描述剪切和转录很困难。

通过long-read sequence可以发现大多数intron的剪切是在转录时发生的，当然这种现象也因组织而异。除了共转录剪切，也存在大量的转录后剪切，这些mRNA在多聚腺苷酸化后bound在染色质上。

通过对chromatin-bound RNA进行捕获后发现，处于延伸中的RNA占了70%，而多聚腺苷酸化的RNA只有30%。有了这些数据后，进一步的研究剪切和转录的关系。

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进一步对处于elongating中的full-read 分析发现，有将近20%的read，存在至少一个已经剪切的intron，而有50%的内含子，在聚合酶II跨过3’剪切位点1100bp后,仍旧没有被剪切掉。

不同颜色代表不同类型的mRNA，和对应的比例

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由于文章的方法能够同时追踪来自同一个转录本的多个intron的状态，作者比较了任意两个相邻的intron的剪切顺序，发现有70%是上游的intron先发生剪切。

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进一步比较了包含多个intron 的基因转录动态过程，发现上游intron被剪切的比例更高一些，同时又一部分的上游intron已经被剪切掉了，在聚合酶II越过下游内含子时，也有一部分上游内含子在下游内含子都剪切掉的情况、多聚腺苷酸化后仍旧没有被剪切。

还存在相邻两个intron协助剪切的情况，可能是由于位于同一个transcript上的intron通过招募一些剪切复合物来帮助其他intron剪切。

柱状图中恒坐标表示第几个外显子，例如S2中当聚合酶II越过第2个内含子时，两个intron就有4中可能，对应4种比例

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研究多聚腺苷酸化的transcript的剪切情况，其中有30%没有完全的剪切掉内含子，并且大多数为剪切的转录本只包含了一个或少数未剪切的intron。分析这些未完全剪切的transcript是否会从染色质上释放，

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通过分析那些未剪切比例大于0,.1的transcript在细胞核和细胞质中的含量，表明这些transcript仍旧bound在chromatin上，在多聚腺苷酸化后，同时FPKM分析也表明，驻留在chromatin上的表达量相比于细胞核、细胞质中的更高。unspliced的intron如果释放到细胞质中会被NMD降解，通过upf1敲除后，没有NMD发现unspliced的含量没有变化。

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当分析RNA-seq数据时，内含子错误的注释是很常见的，因此作者选择了constitutively spliced introns 进行了下一步的分析。为了研究pts intron中调控内含子剪切的因素，作者选择了6521份RNA-seq数据进行分析，其中包括一些突变体、不同调节处理的材料。其中有10份突变材料中，500个intron的保留率相比于野生型有所提高。其中就包括已经报导的PRMT5 、*SKIP 两个基因。这两个基因主要是促进pts transcript 中Intron的剪切，当然对于非pts也有一定的影响。

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PRMT5 is implicated in various developmental processes, such as flowering time control, stress response and circadian rhythm, by promoting the recruitment of NineTeen Complex to the spliceosome and modulating pre-mRNA splicing of diverse genes

在细胞核中保留的已经多聚腺苷酸化，但是没有完全剪切的transcript，被存储在细胞核中防止被NMD降解，可能是在机体受到环境刺激时，激活剪切机制，产生具有功能的mRNA。

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