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# 第7个结果

* 各个剪切事件并不是显著性的差异
* ES数据核实一下
* 同源基因之间的poly A的差异
* 组成型intron与剪切intron之间长度差异
* 同源基因在各个棉种的比较中AS的差异
* 同源基因间表达的差异与保守度
* 各个基因组中TE的插入

## 处理A2的原始数据

参考

> <https://www.omicsclass.com/article/344>

AS数据的处理，由于D5基因组相比A2基因组，注释的转录本更多，这里看一下只考虑PacBio测序得到的与参考基因组进行比较的结果

> for i in A2 D5 TM-1; do for j in IntronR AltA AltD AltP ExonS Other; do printf ${j}"\t"; grep ${j} ../${i}/end\_third|grep PB|wc -l; done; done
>
> 和对应的基因数目
>
> for i in A2 D5 TM-1; do for j in IntronR AltA AltD AltP ExonS Other; do printf ${j}"\t"; grep ${j} ../${i}/end\_third|grep PB|cut -f2|sort|uniq|wc -l; done; done

| 基因组  | IR    | AltA | AltD | AltP | ES   | Other |
| ---- | ----- | ---- | ---- | ---- | ---- | ----- |
| A2   | 28078 | 5199 | 4135 | 1823 | 2276 | 1435  |
| D5   | 22226 | 3257 | 2434 | 1131 | 1719 | 1039  |
| TM-1 | 40354 | 7823 | 6854 | 4665 | 3071 | 2539  |
| At   | 19869 | 3868 | 3341 | 2301 | 1531 | 1197  |
| Dt   | 20436 | 3946 | 3505 | 2363 | 1540 | 1342  |

## 看看公司跑的数据，最后就使用这个数据了

> 鉴定可变剪切的原理:
>
> 1. 将PacBio测得的isoform比对到参考基因组，获得isform 注释信息
> 2. 将PacBio isoform信息与参考基因组组中原有的注释信息进行合并
> 3. 使用脚本，根据合并后的注释信息中的基因结构信息，提取对应剪切事件和发生的位置
>
> 由于A2基因组中原有的注释信息里没有不同转录本的注释信息，并且PacBio测序只测了leaf这一个组织，所以在与A2中原有的注释信息合并后，也不能完全的代表所有的转录本的注释信息
>
> 而D5和TM-1基因组中有不同转录本的注释信息，因此在根据基因结构去鉴定AS的时候，有有一些差异。
>
> 为了减少这个带来的差异，我在各个棉种中选择那种只被PacBio isoform支持的AS
>
> 没有统计scaffold上的AS事件

* AS事件数目

| 基因组  | IR    | AltA | AltD | AltP | ES   | Other |
| ---- | ----- | ---- | ---- | ---- | ---- | ----- |
| A2   | 36574 | 5847 | 4472 | 4394 | 2352 | 4269  |
| D5   | 30379 | 5350 | 3845 | 4185 | 2229 | 6302  |
| TM-1 | 51453 | 9749 | 8252 | 7358 | 3723 | 7915  |
| At   | 25386 | 4878 | 4011 | 3621 | 1850 | 3882  |
| Dt   | 26067 | 4871 | 4241 | 3737 | 1873 | 4033  |

* gene 数目

| 基因组 | IR    | AltA | AltD | AltP | ES   | Other |
| --- | ----- | ---- | ---- | ---- | ---- | ----- |
| A2  | 9139  | 3147 | 2614 | 2200 | 1499 | 1881  |
| D5  | 7466  | 2900 | 2295 | 2214 | 1443 | 2285  |
| TM1 | 13574 | 5414 | 4740 | 3780 | 2399 | 3308  |
| At  | 6657  | 2709 | 2345 | 1872 | 1210 | 1672  |
| Dt  | 6917  | 2705 | 2395 | 1908 | 1189 | 1636  |

### 提取FESTs序列

```bash
python ~/scripte/Alternative/module/extractFEST2.py -p ~/work/Alternative/result/Gh_result/CO31_32_result/06_Alignment/all.collapsed.gtf  -r ~/work/Alternative/data/Ghirsutum_genome_HAU_v1.0/Ghirsutum_gene_model.gtf -AS ~/work/Alternative/result/Gh_result/CO31_32_result/11_AS/end_splice.txt  -g ~/work/Alternative/data/Ghirsutum_genome_HAU_v1.0/Ghirsutum_genome_HAU_v1.0.fasta  -IR 1 -ES 2 -AltA 3 -AltD 4
## D5在分析的时候，取的是CDS坐标

##拆分At与Dt
```

### blast分析保守性

* 相似度80% ，覆盖度80%以上 e-value 1e-5

统计每种AS对应的比例

```bash
# evm.TU.Ga01G0013        0       Ghir_A01G000130 0
出现这种情况是因为，这个基因不存在IR事件，但是存在AltA获取AltD等其他事件
## 统计同时存在AS的基因数，和AS数目
for i  in `ls .`; do  printf ${i}"\t"; awk '$2!=0&&$4!=0{a+=1;b+=$2+$3}END{print a"\t"b}' ${i}; done
## 统计保守的基因数，与AS数
```

#### 保守IR事件

> 存在保守事件基因的比例：
>
> 再计算每个基因，AS事件的保守程度：
>
> 保守基因的比例:
>
> 1. 2425/7142  33.95%
> 2. 2274/6594  34.48%
> 3. 31.91%
> 4. 62.59%
>
> 保守事件的比例:
>
> 1. 4789/36144 \*2  26.50%
> 2. 26.95%
> 3. 24.14%
> 4. 50.14%

| 比较         | 基因对数 | 事件数   | 保守基因对数 | 保守事件数没乘2 |
| ---------- | ---- | ----- | ------ | -------- |
| A2 vs At   | 7142 | 36144 | 2425   | 4789     |
| D5 vs Dt   | 6594 | 32642 | 2274   | 4398     |
| A2 vs D5   | 7218 | 35364 | 2303   | 4269     |
| At  vs  Dt | 2911 | 13551 | 1822   | 3397     |

#### 保守ES事件

> 保守基因的比例:
>
> 1. 31.10%
> 2. 32.11%
> 3. 23.28%
> 4. 56.40%
>
> 保守事件的比例:
>
> 1. 33.85%
> 2. 36.47%
> 3. 26.42%
> 4. 65.40%

| 比较         | 基因对数 | 事件数  | 保守基因对数 | 保守事件数没乘2 |
| ---------- | ---- | ---- | ------ | -------- |
| A2 vs At   | 598  | 1152 | 186    | 195      |
| D5 vs Dt   | 570  | 1146 | 183    | 209      |
| A2 vs D5   | 524  | 984  | 122    | 130      |
| At  vs  Dt | 250  | 474  | 141    | 155      |

#### 保守AltA事件

> 保守基因的比例：
>
> 1. 55.22%
> 2. 48.02%
> 3. 41.05%
> 4. 45.61%
>
> 保守事件的比例:
>
> 1. 48.47%
> 2. 48.25%
> 3. 41.08%
> 4. 45.98%

| 比较         | 基因对数 | 事件数  | 保守基因对数 | 保守事件数没乘2 |
| ---------- | ---- | ---- | ------ | -------- |
| A2 vs At   | 891  | 2030 | 433    | 492      |
| D5 vs Dt   | 835  | 1919 | 401    | 463      |
| A2 vs D5   | 765  | 1704 | 314    | 350      |
| At  vs  Dt | 820  | 1792 | 374    | 412      |

#### 保守AltD事件

> 保守基因的比例：
>
> 1. 49.92%
> 2. 46.88%
> 3. 40.26%
> 4. 46.22%
>
> 保守事件的比例:
>
> 1. 52.32%
> 2. 51.19%
> 3. 44.55%
> 4. 49.36%

| 比较         | 基因对数 | 事件数  | 保守基因对数 | 保守事件数没乘2 |
| ---------- | ---- | ---- | ------ | -------- |
| A2 vs At   | 659  | 1380 | 329    | 361      |
| D5 vs Dt   | 640  | 1344 | 300    | 344      |
| A2 vs D5   | 544  | 1055 | 219    | 235      |
| At  vs  Dt | 662  | 1414 | 306    | 349      |

### 比较不同的AS类型，保守程度是否存在差异

* 计算保守基因对，的AS事件保守程度

> - 不同剪切事件在多倍化的过程中，保守的程度不一样，其中ES最保守，而IR保守性最低

![不同AS事件，保守性不一样](https://s1.ax1x.com/2020/05/14/YB0aD0.png)

* 同一类剪切事件，在不同基因组的比较中的保守程度差异

> A2 vs At 叫保守，D5 vs Dt叫保守；
>
> A2 vs D5叫并行分化，At vs Dt叫趋同进化

### 不同剪切事件的长度差异

* 组成型的内含子
* 保守的剪切事件对应的intronR
* 不保守的剪切事件对应的intronR

```bash
#所有的型内含子
extract_splice_sites.py ~/work/Alternative/result/Gh_result/CO31_32_result/07_annotation/merge.gtf  >1111
awk '{print $1,$2+2,$3,$4}' OFS="\t"  1111 >all_intron.bed
 awk '{print $1,$2+2,$3,$4}' OFS="\t" ~/work/Alternative/data/Ghirsutum_genome_HAU_v1.0/Ghirsutum_gene_model_splce.txt >> all_intron.bed
sort -k1,1 -k2,3n all_intron.bed |uniq >1111
mv 1111 all_intron.bed

 ~/software/bedtools2-2.29.0/bin/intersectBed  -loj -a ../all_intron.bed  -b ./As_intronR.bed  >222
# 发生剪切的内含子
grep ">" ../../../TM1/1|sed 's/>//g'|awk -F "-" '{print $2"\t"$3"\t"$4"\tAlternative"}' |uniq  >As_intronR.bed

#组成型的intron
 awk '$5=="."{print $0}$5!="."&&($7-$6)/($3-$2)<0.4{print $0}' 222|cut -f1,2,3|sort |uniq |awk '{print $0"\tConstitutive"}'>constitutive_intron.bed
#存在剪切的内含子中保守的
cut -f3 ../../../blast/IR/A2_At_conserve_end|awk -F "-" '{print $2"\t"$3"\t"$4"\tconserve"}' >conserveAS.bed
#存在剪切的内含子中不保守的
 cat conserveAS.bed  As_intronR.bed |sort |uniq -u >noconserveAS.bed
```

* 组成型的外显子
* 发生ES的外显子
* 保守的ES

```bash
##所有exon坐标
 cat ~/work/Alternative/result/Gh_result/CO31_32_result/07_annotation/merge.gtf ~/work/Alternative/data/Ghirsutum_genome_HAU_v1.0/Ghirsutum_gene_model.gtf |awk '$3~/exon/{print $1,$4,$5,$7}' OFS="\t" >all_exon.bed
 sort -k1,1 -k2,3 all_exon.bed |uniq >111
 mv 111 all_exon.bed
 ## 发生剪切的exon的坐标
 cat ../../../TM1/ES_length >./As.bed

 ##组成性exon
 cat all_exon.bed  As.bed |cut -f1,2,3|sort |uniq -u |awk '{print $0"\tconstitutive"}' >constitutive.bed

 ## 保守的ES的坐标
cut -f3 ../../../blast/ES/A2_At_conserve_end|xargs  -I {} grep {} As.bed |awk '{print $0"\tconserve"}' >conserve.bedd
 ## 不保守的ES坐标
cut -f1-4 conserve.bed|cat -  As.bed |sort |uniq -u |awk '{print $0"\tnocnoserve"}' >noconserve.bed
```

### 对多倍化过程中的剪切事件进行分类

* parallel conserve
  * A2与D5中保守，在At与Dt中同样保守
  * A2与D5中不保守，但是在At与Dt中保守；A2 At或者D5 Dt中存在保守
* bias conserve
  * A2与D5中保守，但是在At与Dt中不保守；A2 At或者D5 Dt中存在保守
  * A2与D5中不保守，在At与Dt中同样不保守；但是在A2  At或者D5  Dt中是保守的

```bash
## 目录 ParallelEvolution
```

#### 四倍体内同源基因更多的发生分化

分析A2与D5中保守的剪切事件，在At、Dt中的保守情况 1. A2 D5中保守，在At与Dt中同样保守 2. A2 D5中保守，在At与Dt中不保守

A2和D5基因组分别是一个独立的个体，存在一些保守的AS，维持正常的生命活动；

剪切机制的存在往往是为了让植物能够快速响应外界环境的变化，在正常的环境中这种机制的存在往往是能量的浪费，因此在四倍体中，发现大多数原来在二倍体内保守的剪切事件，在四倍体内发生了分化，只在At中存在，或者只在Dt中存在，这两种比例各占一半

> A2和D5作为一个独立的个体，因此具有一些保守的剪切事件；而剪切事件往往是一种能量的浪费；在四倍体内只需要某一个基因组存在对应的AS即可

| 类型     | 二倍体内保守 | 四倍体内保守 | 四倍体内不保守 |
| ------ | ------ | ------ | ------- |
| IR基因   | 2303   | 536    | 1154    |
| IR事件数  | 4269   | 838    | 1697    |
| ES基因   | 122    | 21     | 46      |
| ES事件   | 130    | 22     | 47      |
| AltA基因 | 314    | 48     | 121     |
| AltA事件 | 350    | 51     | 127     |
| AltD基因 | 219    | 37     | 77      |
| AltD事件 | 235    | 40     | 80      |

> 绘制图形
>
> 在画一个维恩图，A中保守的，D中保守的，At、Dt中同样保守的比例

```bash
##A基因组中保守的事件数
cat 1 2 3 4 |grep "Ghir_A"|grep "evm"|awk '{print $1"^"$2"^"$3"^"$4}'>Agenome_conserve.txt
cat 1 2 3 4 |grep "Ghir_D"|grep "Gor"|awk '{print $1"^"$2"^"$3"^"$4}' >Dgenome_conserve.txt
```

![四倍体内存在分化](https://s1.ax1x.com/2020/05/17/YgcPED.png)

![事件数目统计](https://s1.ax1x.com/2020/05/18/Yh5x0g.png)

### 看剪切事件在两个亚基因组间是否存在偏向性

> 只在A基因组中保守的剪切事件，占A2和At中保守事件的比例
>
> 只在D基因组中保守的剪切事件

| 事件类型 | 只在A保守的占A中所有保守比例 | 只在Dt中保守的占D中所有保守的比例 |
| ---- | --------------- | ------------------ |
| IR   | 3623/4461       | 3189/4027          |
| ES   | 164/176         | 154/186            |
| AltA | 394/445         | 358/409            |
| AltD | 287/327         | 270/310            |

![剪切事件是否存在偏向性](https://s1.ax1x.com/2020/05/18/Yh57tA.png)

### 分析每个基因组中特异剪切事件对应的GO

* 在A基因组中特异的AS对应的基因富集的GO
* 在D基因组中特异的AS对应的基因富集的GO
* A、D中保守的AS对应的基因富集的GO

```bash
#在A基因组特异的
cut -f3 1|awk '{print "^^"$0"^"}'|cat - Agenome_conserve.txt | awk -F "^" '{print $3}'|sort|uniq -u|cut -f1 -d "-"|sort|uniq |xargs  -I {} grep {} ~/genome_data/Ghirsutum_genome_HAU_v1.1/Gh_Noscagenes_GO_V3_At.annot >A.GO
#在D基因组中特异的
cut -f4 1 |awk '{print "^^^"$0}'|cat - Dgenome_conserve.txt |awk -F "^" '{print $4}'|sort|uniq -u|cut -f1 -d "-"|sort|uniq |xargs  -I {} grep {} ~/genome_data/Ghirsutum_genome_HAU_v1.1/Gh_Noscagenes_GO_V3_Dt.annot >D.GO
```

### 分析可变剪切对基因表达式水平的影响

* At与Dt中存在保守事件的基因
* At与Dt中仅仅只有一个亚基因组中存在保守事件的基因

> 存在保守事件的同源基因对间的差异表达情况
>
> 不存在保守事件的同源基因对的差异表达情况
>
> Divergence of duplicated genes by repeated partitioning of splice forms and subcellular localization

```bash
## 获取同源基因对
cat 1 2 |awk '{print $3"\n"$4}' |awk  -F "-" '{print $1}'|sort |uniq
cat 3 4 |awk '{print $3"\n"$4}' |sed '/*/d'|awk  -F "-" '{print $1}'|sort |uniq

## 获得同源基因对间的表达量
python homolog_expresion.py  -homolog ~/work/Alternative/result/homologo/homologGene/At_vs_Dt_collinerity.txt  -gene IR/At_Dt_bias_gene_ID  -FPKM ~/work/RNA-seq/hisat2_out/leaf/leaf_BAM/Gh/gene_fpkm.txt  -o IR/bias_fpkm
```

## 剪切事件在多倍化过程中的变化

* 在二倍体中存在的事件，并且在四倍体中At、Dt保守；多倍化之前就存在的事件
* 在二倍体中不存在的事件，但是在四倍体中保守；多倍化后新产生的事件

```bash
# 上个分类中1、2 文件

# 新产生的做个排除法
```

## 参考

方差分析 <https://zhuanlan.zhihu.com/p/57756620>

卡方检验 <https://zhuanlan.zhihu.com/p/42803826>


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